Şimdiki kentin olduğu bölgede MÖ 4. yüzyılda Antigonia adlı bir başka kent vardı. Seleukos kralı I. Seleucus Antigonia´yı tamamen yıktırdı. Aynı yerde tahta geçişinin 12. yılında, MÖ 22 Mayıs 300 tarihinde törenle yeni bir kentin temelini attı. Bu kentin inşasında Antigonia´nın artık malzemesi kullanıldı, Antigonia halkı yeni kente aktarıldı ve burası Seleukos Devleti´nin merkezi oldu. Seleukos´un babasının adına izafeten"Antiokheia" adını verdiği bu yeni kent, Seleucus tarafından aynı adla kurulan 16 kentten biridir. Antakya diğerlerinden "Asi kenarındaki Antakya" veya "Defne yakınındaki Antakya" adlarıyla ayrılır.
Bilindiği kadarıyla Defne´nin (Harbiye) kuruluşu Antakya´dan öncedir. Seleukos Nikator; Defne´de güzel caddeler, tiyatro, mesire yerleri kurdu. Tapınakları ve caddeleri, başta Apollon heykeli olmak üzere heykellerle süsledi.
Aslında Defne´ye bu kadar önem verilmesinin tek sebebi, buranın sayfiye yeri oluşu değil, daha çok mitolojideki konumu (Defne kutsal efsanesi) nedeniyle buranın kutsal sayılmasıydı.
"lzgara plan" olarak tanımlanan ve Xenarius tarafından çizilen kent planında sokaklar kışın güneşi görecek, yazın ise; Asi Vadisi´nden gelen rüzgarı alacak şekilde düzenlenmiştir. Lazkiye’nin planının da aynı olması nedeniyle Antakya ve Lazkiye uzun süre "kardeş" veya ikiz kentler" olarak tanımlandı. İmparatorluğun başkenti olan Antakya, zamanla dünya çapında önemli bir ticaret ve sanayi merkezi oldu.
Kent, her biri ayrı surlarla çevrili dört mahalleden meydana geldiği için Antakya´yı "tetrapolis" (dördüz şehir) olarak nitelemiştir:
İlk iki mahalle krallığın kurucusu Seleukos I.Nikator tarafından Asi kenarında kurulmuş, birine Makedonyalılar ve Yunanlılar, öbürüne Suriyeliler yerleştirilmiş.
Ası nehri içinde bulunan üçüncü mahalle Seleukos II.Kallikinos (MÖ 246-226) tarafından kurulmuştur. Kral sarayı burada idi.
Epifania adı verilen dördüncü mahalle ise Silpius Dağı eteğinde, kente en parlak dönemi yaşatan Antiokhos IV. Epifanes (MÖ 175-164) tarafından kurulmuştur.
MÖ 195 yılında Antiokhos III. döneminde Kartacalı Anibal Antakya´yı ziyaret etti. Bu dönemde Antakya´nın bölgede ticari ve askeri yönlerden önemli bir yeri vardı. Seleucos Devletinin başkenti olmanın ayrıcalığını taşıyan kent görkemli yapılarla donatılmıştı. Antiokhos Epifanes kentte su kemeri, kent Kurulu binası, Jupiter Kapitolinus Tapınağı ve daha önceki devlet agorasından başka bir de ticaret agorası yaptırdı. O dönemde sadece Miletos ve Pergamon gibi büyük kentlerde iki agora bulunurdu. Meyve bahçeleri, muhteşem yapıları ve anıtları ile herkesi cezbeden şehirde sık sık şölenler ve olimpiyatlar düzenleniyordu. Başkentin yakınındaki Defne (Daphneia) villalarıyla, caddeleriyle çok güzel bir yazlık kentti. Kent sirk, tiyatro, han, halk hamamları, mermer caddeler, tapınaklar, çeşitli heykellerle süslenmişti. Buraya çoğunlukla hanedan mensupları ve yüksek sosyete gelirdi. MÖ 67 yılında Kilikya Valisi Markius Reks şehirde bir sirk yaptırdı.
